Исследователи из Медицинского института Говарда Хьюза
(США) сумели значительно усовершенствовать один из ведущих методов
световой микроскопии, который позволяет определять положение
флуоресцентных белков в клетках с точностью до 10–20 нм. Ученые создали
новую технологию построения изображений, адаптировав принципы
интерферометрии к существующей технологии. В результате получены
«трехмерные» изображения клеточных структур, с разрешением, до сих пор
не виданным в оптической микроскопии.
«Мы создали прекрасный инструмент для наблюдения за процессами,
происходящими на клеточном уровне», – уверен д-р Харальд Хесс (Harald
Hess, PhD) –директор департамента прикладной физики на
исследовательском кампусе Janelia Farm Медицинского института Говарда Хьюза,
возглавивший разработку микроскопов нового типа. Предложенная методика
получила название iPALM – interferometric PhotoActivated Localization
Microscopy, интерферометрическая светочувствительная локализационная
микроскопия); основой для ее реализации послужила технология PALM,
предложенная д-ром Хессом и его коллегой д-ром Эриком Бетцигом (Eric
Betzig) в 2005 году.
Суть метода PALM состоит в том, что введенные в клетку
флуоресцентные метки активируются (и деактивируются) постепенно, с
помощью световых импульсов: на каждом из снимаемых изображений
«включается» лишь малая их часть. При объединении нескольких тысяч
таких изображений создается цельная иллюстрация всей исследуемой
структуры, на которой отдельно отмечен каждый флуоресцентный белок. В
результате ученые получают гораздо более четкую картину, чем в случае
применения методов традиционной флуоресцентной микроскопии.
Совершенствованием методики PALM занимались оба ее изобретателя: д-р
Бетциг пытался приспособить технологию для исследования живых клеток и
флуоресцентных белков разного цвета свечения, а д-р Хесс собирался
обеспечить получаемым изображениям дополнительное, третье, измерение.
Довольно быстро д-р Хесс пришел к выводу о том, что лучшим способом
определения глубины расположения белка в образце будет интерферометрия,
и уже в сентябре 2006 года он предложил идею iPALM. «Интерферометрия —
один из самых точных методов измерения, — объясняет ученый. — Если у
вас есть источники света достаточной яркости, появляется возможность
измерять сверхмалые величины».
Прежде исследователю приходилось использовать классические
интерферометрические методы для классических же задач – поиска
неровностей на поверхности пластин жесткого диска. Измерения
проводились следующим образом: световая волна посылалась в сторону
изучаемой поверхности, отражалась от нее и сравнивалась с «эталонной»,
отраженной от зеркала, которое устанавливалось на известном удалении от
источника. При обнаружении малейшего отличия расстояния между пластиной
и источником от заданного приемник фиксировал смещение фаз отраженных
волн друг относительно друга. По измеренному значению амплитуды
суммарной волны (в идеале оно должно быть нулевым) определялась высота
неровности с точностью до нанометров.
Основная сложность применения указанной технологии для
изучения биологических образцов состоит в том, что свет испускается не
лазером, а флуоресцентными молекулами, находящимися внутри исследуемого
объекта. Проблема получения «эталонной» волны была решена методом
расщепления фотонов; каждый квант света, таким образом, служил образцом
для самого себя. С помощью стандартного PALM-микроскопа частицы
собирались с обеих сторон пробы, а затем два световых пучка посылались
на светоделительный элемент, который расщеплял их и направлял к трем
отдельным камерам. По результатам измерения интенсивности пучков,
попавших в каждую из камер, делался вывод о глубине расположения метки
в пробе.
Изображение клетки с введенными в нее флуоресцентными белками. Глубина
расположения молекул определяется цветом: красный соответствует самым
нижним слоям, фиолетовый — наиболее приближенным к наблюдателю
(изображение получено д-ром Х. Хессом).
По мнению д-ра Хесса для функционирования новой технологии
достаточно лишь небольшого количества фотонов, что важно с практической
стороны и существенно превосходит по эффективности существующие
методики.
Евгений Биргер |
